Durante l’annata 2015-2016, caratterizzata da un rapporto non idilliaco con Luciano Spalletti (che a gennaio aveva rilevato il posto dell’esonerato Rudi Garcia), Totti trovò poco spazio (anche a causa di problemi fisici); tuttavia, pur non gradendo il minutaggio ridotto, conseguì diversi traguardi individuali, a cominciare dalla rete segnata il 20 settembre 2015 contro il Sassuolo, la 300ª in carriera con la Roma.

Nella gara d’andata dell’ottavo di finale di Champions League contro il Real Madrid, Totti divenne il terzo giocatore più grande di età (39 anni e 143 giorni) ad aver preso parte alle fasi a eliminazione diretta del torneo continentale, dopo Ryan Giggs (40 anni e 123 giorni) e Paolo Maldini (39 anni e 252 giorni). Durante la sfida casalinga contro il Torino del 20 aprile, mise a segno una rete a 22 secondi dal suo ingresso in campo (record stagionale in Serie A e gol più veloce nella carriera del giocatore) e si ripeté pochi minuti dopo su rigore, ribaltando l’incontro da 1-2 a 3-2 per la Roma; i 39 anni e sette mesi di età lo resero il giocatore più grande di età a realizzare una doppietta nella massima serie. Nella medesima partita, superò Roberto Baggio per trasformazioni dal dischetto in Serie A, mettendo a segno il suo 69º rigore in campionato su 86 calciati. Il 2 maggio, subentrò di nuovo nella ripresa nella sfida esterna contro il Genoa e contribuì alla vittoria in rimonta per 3-2 della Roma, siglando il gol del momentaneo 2-2 su calcio di punizione; col suo 21º gol su punizione in campionato, raggiunse Baggio al 4º posto della classifica dei giocatori che hanno realizzato più gol su calcio di punizione in Serie A, dietro soltanto a Siniša Mihajlović (28), Andrea Pirlo (27) e Alessandro Del Piero (22). L’8 maggio, nella partita vinta per 3-0 contro il Chievo, diventò il terzo giocatore a toccare quota 600 partite in Serie A, dopo Paolo Maldini e Javier Zanetti.

Il 20 ottobre 2016, in occasione della partita di Europa League contro l’Austria Vienna, raggiunse quota 100 presenze nelle competizioni UEFA per club. Il 28 maggio 2017 disputò contro il Genoa la sua ultima partita con la maglia della Roma, che fu anche la sua presenza numero 619 in Serie A. La tifoseria romanista rese omaggio al giocatore con una festa di addio tenutasi allo stadio Olimpico al termine della gara. Per volere del giocatore, la maglia numero 10 della Roma, da lui indossata a partire dalla stagione 1997-1998, non è stata ritirata dalla squadra.